Arbeiten mit dem AQUIOS STEM-System auf der Grundlage internationaler Leitlinien zur klinischen Zählung CD34-positiver hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellenl
Dr. Andreas Böhmler
Bei der Analyse von CD34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen handelt es sich um einen der am stärksten regulierten Tests in der klinischen Durchflusszytometrie, denn die Zählung seltener Ereignisse wie z. B. Stammzellen kann in Bezug auf die Vergleichbarkeit und Konkordanz zwischen und innerhalb von Laboren eine Herausforderung darstellen.
In diesem Produktbulletin sind die wesentlichen Bestandteile und technischen Details für die Zählung CD34-positiver Zellen zusammengefasst, die in vier anerkannten internationalen Leitlinien und Standards vorgegeben sind. Darüber hinaus wird beschrieben, wie das AQUIOS STEM-System diese Vorgaben bei der Zählung CD34-positiver Zellen umsetzt, um das Labor bei der Akkreditierung zu unterstützen.
Zu den Leitlinien
Vor dem Hintergrund der zunehmenden Anwendung von mobilisierten peripheren Blutstammzellen (PBSC) und Vorläuferzellen für Transplantationszwecke beschrieben Sutherland et al. in Kollaboration mit der International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) 1996 eine Reihe von Standards für die Zählung CD34-positiver Zellen. Ziel war die Entwicklung einer einfachen, empfindlichen Methode, die ein hohes Maß an Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zwischen den Laboren ermöglicht. Die daraus resultierenden „ISHAGE-Leitlinien“ entwickelten sich schnell zum Goldstandard für die Zählung CD34-positiver hämatopoetischer Vorläuferzellen mittels Durchflusszytometrie.1
Im Jahr 1998 veröffentlichten Keeney et al. eine abgewandelte Version der Leitlinien von 1996. Darin führten sie Beads für die Absolutzählung ein, fügten 7-AAD als Farbstoff zur Viabilitätsbestimmung hinzu, um tote Zellen auszuschließen, und verwendeten ein Lysereagenz ohne Fixativa.2Durch diese Änderungen wurde das Basisprotokoll in eine Ein-Plattform-Methode umgewandelt, und die daraus resultierende Leitlinie „Single platform with viability dye ISHAGE Guidelines“ ist auch über 20 Jahre danach noch weitgehend unverändert. Viele internationale, nationale und regionale Organisationen haben die wesentlichen Bestandteile und technischen Details des ISHAGE-Protokolls für die Zählung CD34-positiver Zellen übernommen. Dazu gehört auch das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.), ein einheitliches Referenzwerk für die Qualitätskontrolle von Arzneimitteln in der Europäischen Union.3 Im Gegensatz zu den ISHAGE-Leitlinien sind die im Ph. Eur. beschriebenen Standards rechtlich bindend, so wie es das Übereinkommen des Europarats über die Ausarbeitung eines Europäischen Arzneibuchs und die Arzneimittelgesetze der EU und der Mitgliedstaaten vorsehen.
Standards für die Transplantation hämatopoetischer Vorläuferzellen werden von der Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT) und JACIE, dem gemeinsamen Akkreditierungsausschuss von ISCT und EBMT (European Society for Blood and Marrow Transplantation), veröffentlicht4. Daneben gibt es für die Verwendung hämatopoetischer Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut noch die durch die NetCord-FACT-Standards vorgegebenen Leitlinien.5
AQUIOS STEM-System
Das AQUIOS STEM-System setzt sich aus der AQUIOS STEM-Software für das AQUIOS CL-Durchflusszytometer, den AQUIOS STEM-Kit-Reagenzien, AQUIOS STEM CD34-Kontrollzellen und Flow-Check-Fluorosphären (Tabelle 1) zusammen und ist ein Medizinprodukt zur Verwendung als In-vitro-Diagnostikum durch Laborfachkräfte, das für den Nachweis der Parameter in den Probentypen in Tabelle 2 (Systemparameter) mit dem automatisierten AQUIOS CL-Durchflusszytometer bestimmt ist.
Es handelt sich um einen quantitativen Assay zur Identifizierung und Zählung der in Tabelle 2 aufgeführten Zellpopulationen bei Patienten, die sich auf eine Transplantation autologer oder allogener hämatopoetischer Vorläuferzellen vorbereiten, und bei Spendern, die sich Mobilisierungs- oder Entnahmeprogrammen für die Transplantation von autologen oder allogenen hämatopoetischen Vorläuferzellen unterziehen. Weitere Informationen zu den unterstützten Probentypen und Antikoagulanzien finden Sie in Tabelle 2.
Tabelle 1. Komponenten des AQUIOS STEM-Systems. Alle Komponenten sind gemäß den Vorschriften der Länder, in denen die Produkte registriert sind, für die In-vitro-Diagnostik vorgesehen.
| Gerät | Bezeichnung |
|---|---|
| AQUIOS CL-Durchflusszytometer | AQUIOS CL-Durchflusszytometer mit Notstromaggregat |
| Software | |
| AQUIOS STEM-Software | Software für die Zählung CD34-positiver Zellen mit Auto-Gating-Algorithmen für das AQUIOS CL. Das QK-Modul der AQUIOS STEM-Software bietet Zugang zu eIQAP (electronic Interlaboratory Quality Assurance Program), dem Programm von Beckman Coulter zur elektronischen laborübergreifenden Qualitätssicherung. Mit diesem Programm können Laboranwender Berichte über Peergroup-Vergleiche ihrer Qualitätskontrolldaten erstellen. |
| Reagenzien | |
| AQUIOS STEM-Kit, 50 Tests | Die AQUIOS STEM-Kit-Reagenzien umfassen ein murines monoklonales CD45-FITC/CD34-PE-Antikörperreagenz, eine dazugehörige negative Kontrolle (CD45-FITC/CD34-CTRL), ein Reagenz zur Bestimmung der Absolutzahl (AQUIOS STEM-Count-Fluorosphären), ein Reagenz zur Bestimmung der Zellviabilität (7-AAD) und ein gebrauchsfertiges Lysereagenz (AQUIOS STEM-Lyselösung). |
| AQUIOS STEM CD34-Kontrollzellen, in 2 Konzentrationen, je 15 Tests | Bei den AQUIOS STEM CD34-Kontrollzellen handelt es sich um Flüssigpräparate stabilisierter humaner Leukozyten, die im Rahmen des AQUIOS STEM-Systems zur Überprüfung der Parameter CD34 und CD45 eingesetzt werden. Jedes Kit enthält CD34 in 2 Konzentrationen, mit ungefähr 10 CD34+ Zellen/µl (Level 1) und ungefähr 30 CD34+ Zellen/µl (Level 2). |
| Flow-Check-Fluorosphären, 3 x 10 ml | Bei Flow-Check Fluorosphären handelt es sich um eine getestete Suspension von Fluorosphären (fluoreszierende Mikrokügelchen), die zur täglichen Überprüfung der optischen Justierung und des Fluidiksystems eines Durchflusszytometers verwendet wird. |
Tabelle 2. Parameter des AQUIOS STEM-Systems
| Specimen Type | Anticoagulanz | Kits/Parameter | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| K2EDTA | K3EDTA | Heparin | Mischung aus Heparin/ACD-Ax | ACD-A | CPD | AQUIOS Stem-Kit | |
| Vollblut (WB) | X | X | X | Prozent CD34 Absolutzah CD34 Absolutzah CD45 |
|||
| Mobilisiertes Vollblut (MB) | X | X | X | ||||
| Frisches oder aufgetautes Knochenmark (BM) | X | X | X | X | |||
| Frisches oder aufgetautes Aphereseprodukt (AP) | X | X | |||||
| Frisches oder aufgetautes Nabelschnurblut (CB) | X | X | |||||
In diesem Produktbulletin sind die in den oben angeführten Leitfäden genannten Anforderungen an die Zählung CD34-positiver Zellen zusammengefasst. Es wird beschrieben, wie diese Anforderungen im AQUIOS STEM-System umgesetzt werden, um das Labor bei der Akkreditierung zu unterstützen. Die in diesem Dokument erläuterten Kategorien und Anforderungen erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Vielmehr beziehen sie sich schwerpunktmäßig auf die technischen Aspekte der Zählung CD34-positiver Zellen. Andere Bereiche der Leitlinien und Standards, die die allgemeinen Anforderungen an Labor, Einrichtung und Qualitätsmanagement regulieren, werden dabei nicht berücksichtigt.
Internationale Leitlinien und Standards für die Analyse CD34-positiver hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen
- ISHAGE-Leitlinien
- Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.)
- Internationale Standards für die Entnahme, Verarbeitung und Verabreichung hämatopoetischer Zelltherapieprodukte von FACT – JACIE
- Internationale Standards für die Entnahme, Lagerung und Freigabe von Nabelschnurblut zur Verabreichung von NetCord – FACT
Um alle für Ihre Organisation relevanten Standards einzuhalten, sehen Sie bitte die vollständigen Texte der in diesem Produktbulletin genannten Dokumente sowie die lokalen, nationalen oder internationalen Gesetze und Vorschriften ein, die in Ihrem Land gelten.
Quellen
- Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I: The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother. 1996 Jun;5(3):213-26.
- Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR: Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):61-70.
- EDQM Council of Europe: European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). 10th Edition 2019-2022. Website: https://pheur.edqm.eu/home
- Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT), Joint Accreditation Committee – ISCT and EBMT (JACIE): International standards for hematopoietic cellular therapy product collection, processing, and administration. 8th Edition, Version 8.1, 2021. Website: http://www.factwebsite.org/
- Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT): NetCord-FACT international standards for cord blood collection, banking, and release for administration. 7th Edition, 2019. Website: http://www.factwebsite.org/
- Whitby A, Whitby L, Fletcher M, Reilly JT, Sutherland DR, Keeney M, Barnett D: ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Cytometry B Clin Cytom. 2012 Jan;82B:9-17.
